Javascript is momenteel uitgeschakeld in uw browser.Verschillende functies van deze site werken niet als javascript is uitgeschakeld.open toegang tot wetenschappelijk en medisch onderzoekVan indiening tot eerste redactionele beslissing.Van redactionele acceptatie tot publicatie.Bovenstaand percentage manuscripten is in de afgelopen 12 maanden afgewezen.Open access peer-reviewed wetenschappelijke en medische tijdschriften.Dove Medical Press is lid van de OAI.Bulk herdrukken voor de farmaceutische industrie.We bieden onze auteurs echte voordelen, waaronder een snelle verwerking van papers.Registreer uw specifieke gegevens en specifieke geneesmiddelen die u interesseren en we zullen de informatie die u verstrekt koppelen aan artikelen uit onze uitgebreide database en pdf-kopieën onmiddellijk naar u e-mailen.Terug naar Tijdschriften » International Journal of Nanomedicine » Volume 12Auteurs Popa AC, Stan GE, Husanu MA, Mercioniu I, Santos LF, Fernandes HR, Ferreira JMFGepubliceerd op 21 januari 2017 Jaargang 2017:12 Pagina's 683—707DOI https://doi.org/10.2147/IJN.S123236Beoordeling door enkele anonieme peer reviewRedacteur die publicatie heeft goedgekeurd: Dr Thomas J WebsterAC Popa,1,2 GE Stan,1 MA Husanu,1 I Mercioniu,1 LF Santos,3 HR Fernandes,4 JMF Ferreira4 1Nationaal Instituut voor Materiaalfysica, Măgurele, 2Army Center for Medical Research, Boekarest, Roemenië;3Centro de Química Estrutural, Instituto Superior Técnico (CQE-IST), Universiteit van Lissabon, Lissabon, 4Department of Materials and Ceramics Engineering, Centre for Research in Ceramics and Composite Materials (CICECO), University of Aveiro, Aveiro, Portugal Abstract: Synthetische fysiologische vloeistoffen worden momenteel gebruikt als een eerste in vitro bioactiviteitsbeoordeling voor bottransplantaten.Ons begrip van de interacties die plaatsvinden op de vloeistof-implantaatinterface is de afgelopen tien jaar opmerkelijk geëvolueerd en voldoet niet aan de traditionele International Organization for Standardization/definitief ontwerp van het International Standard 23317-protocol in puur anorganische gesimuleerde lichaamsvloeistof.De vooruitgang in onze kennis wijst op de noodzaak van een echte paradigmaverschuiving naar het testen van fysiologische vloeistoffen met verbeterde biomimicry en een beter begrip van het structuur-oplosgedrag van de materialen.Dit zal bijdragen aan het "upgraden" van onze visie op hele cascades van gebeurtenissen die plaatsvinden op de implantaatoppervlakken bij onderdompeling in de testmedia of na implantatie.Uitgaande van een osteo-inductieve bioglassamenstelling met het vermogen om de oxidatieve stress te verlichten, werden dunne bioglasfilms met verschillende polymerisatiegraden afgezet op titaniumsubstraten.Hun biomineralisatie-activiteit in gesimuleerde lichaamsvloeistof en in een reeks nieuwe anorganisch-organische media met toenemende biomimicry die de menselijke intercellulaire omgeving beter simuleerde, werd vergeleken.Een uitgebreide reeks geavanceerde karakteriseringstools (scanning-elektronenmicroscopie; röntgendiffractie met begrazingsincidenten; Fourier-transform infrarood, micro-Raman, energiedispersief, röntgenfoto-elektron en oppervlakteversterkte laserdesorptie/ionisatietijd van vluchtmassaspectroscopieën en cytocompatibiliteitstesten met behulp van mesenchymale stamcellen) werden gebruikt.De verzamelde informatie is zeer nuttig voor biologen, biofysici, clinici en materiaalwetenschappers met speciale interesse in onderwijs en onderzoek.Door alle analyses te combineren, stellen we hierin een stap voorwaarts voor in de richting van het vaststellen van een verbeterd uniform protocol voor het testen van de bioactiviteit van implantaatmaterialen.Trefwoorden: biomaterialen, bioglas, in vitro biomimetische testen, eiwittenHet vermogen van bepaalde glasformuleringen op silicabasis om harde en zachte weefsels te binden, werd eind jaren zestig ontdekt door Hench et al.1 Sindsdien zijn er nieuwe glasformuleringen voorgesteld om de functionaliteiten van bioactief glas (BG) uit te breiden, waaronder nanogestructureerde coatings die zijn gesynthetiseerd door chemische en fysische methoden, laagdimensionale objecten voor medicijnafgifte of regeneratieve botsteigers vervaardigd door additieve fabricage, robocasting of 3D-printen.2-8Momenteel wordt de bioactiviteit van BG's routinematig beoordeeld door hun onderdompeling in gesimuleerde lichaamsvloeistof (SBF) -oplossing, een simplistische methode die geen rekening houdt met de complexe biologische processen die plaatsvinden na implantatie.De synthetische SBF-oplossing die in 1990 in de wetenschappelijke gemeenschap werd geïntroduceerd door Kokubo et al. reproduceert alleen de anorganische samenstelling van fysiologische media (dwz bloedplasma).9 De opmerkelijke eenvoud van zowel de chemische bereiding van SBF als het in vitro testprotocol werd snel waargenomen door de wetenschappelijke gemeenschap van biomaterialen.Ondertussen werden verschillende wijzigingen van de basisformule voorgesteld door de Oyane et al,10,11 zoals beschreven in een samenvattend artikel.12 Dergelijke initiatieven culmineerden in een internationaal gestandaardiseerde in vitro test uit 2007: International Organization for Standardization (ISO)/final concept International Standard (FDIS) 23317 (laatst herzien in 2014).13 Het voorspellend vermogen ervan werd kort daarna in twijfel getrokken door Bohner en Lemaitre.14 Hun Scopus-zoekopdracht (www.scopus.com) gebruikte de trefwoorden "bioactiviteit" en "gesimuleerde lichaamsvloeistof" (in alle velden) leidde tot 1.975 treffers in 2009 en een gelijkaardige zoekopdracht in 2016 leidde tot 7.475 treffers (6.123 sinds 2007)!Dit betekent dat, ondanks de geuite kritiek, deze eenvoudige in vitro SBF-testmethode erg populair en klassiek is geworden voor het beoordelen van de bioactiviteit/bioreactiviteit van verschillende materialen (bijv. glazen, apatieten).Het ISO/FDIS 2331713 protocol stelt voor om testmonsters (schijven of vierkanten met een diameter/grootte van 10±2 mm en een dikte van 2±1 mm) onder te dompelen in SBF bij pH 7,4 en 36,5°C gedurende verschillende perioden gedurende 4 weken, zonder enige specifieke indicatie over de atmosfeer.Hoewel schijf- of rechthoekige plaatmonsters de voorkeur hebben vanwege hun gemak bij het instellen van de aanbevolen Vs:Sa-verhouding op 100 mm (Vs is het volume van de SBF-oplossing [mm3] en Sa het schijnbare oppervlak van het monster [mm2]), monsters van elk configuratie en grootte kan worden gebruikt.Kan het vermogen van een materiaal om de vorming van een hydroxyapatiet (HA)-oppervlaktelaag te induceren wanneer het wordt ondergedompeld in SBF-oplossing echter worden gezien als een duidelijke voorspeller van bioactiviteit en het vermogen ervan om botweefselrehabilitatie te induceren?Aangezien SBF slechts een verzameling elektrolyten is, heeft het testen van SBF enkele duidelijke tekortkomingen:De meeste literatuurstudies hebben zich gericht op het testen van bulkmaterialen.Indien vermeld, varieert de hoeveelheid BG-materiaal per SBF-volume tussen ~0,005 en 30 mg/mL (zie tabel 1), wat een nogal heterogene interpretatie betekent van gegevens verzameld door dit type in vitro-assay, waardoor vergelijkende interstudie-analyses worden uitgesloten.Tabel 1 Voorbeelden van monstermassa: gesimuleerde volumeverhoudingen van lichaamsmedia die worden gebruikt in bioactiviteitstests van keramische materialen Opmerkingen: * Zoals beschreven in het aangehaalde artikel.Gemiddelde massadichtheid van 2,7 g/cm3,63,101 3,15 g/cm3,16 en 2,3 g/cm3,102 is in overweging genomen bij de volume-naar-massaconversie van respectievelijk BG-, HA- en brushietmonsters.Afkortingen: BG, bioactief glas;HA, hydroxyapatiet;Sa, schijnbare oppervlakte van het monster;TCP, tricalciumfosfaat;Vs, volume van SBF-oplossing.Een andere vereenvoudiging is de synthetische en wetenschappelijke beschrijving van het botgenezingsproces (momenteel bekend als het Hench-mechanisme), 16-19, waarin staat dat alleen na mineralisatie (dwz chemische groei en kristallisatie van HA) het proces van chemoattractie en adhesie van stam cellen naar de oppervlakte komen.Celadhesie op oppervlakken kan binnen 2-4 uur optreden, en vervolgens begint de proliferatie binnen de eerste 12 uur, 20-22 dus waarschijnlijk voordat de HA-laag zich op die oppervlakken begint te ontwikkelen in echte biomimetische omstandigheden.Bovendien wordt het bot tijdens de genezing onderworpen aan een hermodelleringsfase waarin osteoclasten HA uit de botmatrix halen en de eiwitachtige 3D-architectuur van de botmatrix op microscopisch niveau veranderen.Daarom blijkt het hele botgenezingsproces rond een implantaat veel complexer te zijn dan gepresenteerd in het mechanisme van Hench,16-19 en is dus moeilijk te voorspellen met een eenvoudige SBF-test.Al deze aspecten doen twijfel rijzen rond de klassieke methodologie van het testen van bioactiviteit door onderdompeling van materialen in SBF.De Duitse filosoof Arthur Schopenhauer zei ooit: "De ontdekking van de waarheid wordt effectiever verhinderd, niet door de valse schijn die aanwezig is en die tot dwaling leidt, niet direct door zwakte van het redeneervermogen, maar door een vooropgezette mening, door vooroordelen".23 De zoektocht naar de waarheid is de drijvende kracht die onderzoekers, wetenschappers en filosofen evenzeer motiveert.In dit proces moet de onderzoeker eerst zijn eigen ideeën in twijfel trekken, namelijk de aanklager, de verdediger en de rechter.Desalniettemin is een eenvoudige, goedkope maar wetenschappelijk nauwkeuriger in vitro bioactiviteit-screeningtest nog steeds (ondubbelzinnig) noodzakelijk, en zou zeer gunstig zijn voor de wetenschappelijke gemeenschap.Het gebruik van synthetische lichaamsvloeistof met verbeterde biomimicry zou niet alleen extrapolatie van het gedrag van een bepaald materiaal in een levend organisme mogelijk maken, maar ook dienen als een betrouwbare selectiemethode voor materialen, voorafgaand aan de dure in vitro tests in celculturen en/of in vivo testen in diermodellen.Het is ons op grond van rede, ethiek, wetten of economie niet toegestaan ​​om een ​​willekeurig aantal dieren te onderwerpen aan pijnlijke procedures bij gebrek aan solide bewijs van potentiële biofunctionaliteit.In de loop der jaren is er weinig aandacht besteed aan de aanpak van dit specifieke onderwerp.Voor zover wij weten, dateren alternatieve voorstellen voor SBF uit het jaar 2000.24 Soortgelijke maar onvolledige vragen zijn gesteld door een klein aantal onderzoekers.14,15,24-30 Onze studies behoren tot de baanbrekende werken op het gebied van complexe biomimetische testoplossingen met organische/anorganische componenten.31,32 Het onderwerp kreeg meer aandacht na het ondervragingswerk van twee vooraanstaande wetenschappers.14 Het geleidelijk toegenomen bewustzijn van de onderzoeksgemeenschap van de tekortkomingen van SBF-testen14,15,33 heeft gewezen op de behoefte aan betrouwbaardere bioactiviteitstestprotocollen met verbeterd voorspellingsvermogen van in vivo gedrag.De huidige studie wil een bijdrage leveren aan dit belangrijke doel.De bioactiviteit van BG-films werd onderzocht met behulp van verschillende testoplossingen en protocollen: 1) volgens ISO/FDIS 23317 in SBF,13 en 2) met behulp van anorganisch-organische oplossingen (met en zonder eiwitten) die het menselijke fysiologische intercellulaire medium beter nabootsen ( bijv. Dulbecco's Modified Eagle's Medium [DMEM]) gebruikt voor het in vitro kweken van cellen.In sommige gevallen werd DMEM verder aangevuld met eiwitten die in menselijk plasma worden aangetroffen, omdat ze een harmonieuze in vitro groei van cellen mogelijk maken.Het doel was om te evalueren of dergelijke aminozuren en/of eiwitten worden geadsorbeerd op het oppervlak van de geteste monsters en om de aard van een dergelijke organische laag te begrijpen en hoe deze het biomineralisatieproces verstoort.BG-coatings met verschillende silicagehaltes werden op titaniumsubstraten afgezet.De rol van de glazen netwerkconnectiviteit (NC) bij het bepalen van de oplossnelheid van BG in waterige media en daarmee de biomineralisatiecapaciteit ervan is algemeen bekend en biedt een solide en betrouwbare basis om de bevindingen en hun interpretatie hier gerapporteerd te ondersteunen.Er wordt ook een uniform protocol voorgesteld voor het testen van de bioactiviteit van implantaatmaterialen, ongeacht de samenstelling van het testmedium of de fysieke vorm van specimens.Het uitgangsmateriaal voor de filmbereiding bestond uit een bioactief en cytocompatibel alkalivrij BG-poeder met ZnO-additief34 met de volgende nominale samenstelling (mol%): SiO2 38.5, CaO 36.1, P2O5 5.6, MgO 15.2, ZnO 4 en CaF2 0.6.Hoogzuivere poeders van SiO2 (>99,5%; Merck, Darmstadt, Duitsland), CaCO3 (>99,5%; Merck), MgCO3 (>99%; Merck), ZnO (>99%; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO , VS), NH4H2P04 (>99%; Sigma-Aldrich) en CaF2 (>99,9%, 325 mesh; Sigma Aldrich) werden gebruikt voor het bereiden van de BG.Homogene mengsels van batches (~ 100 g) verkregen door middel van droog malen in een kogelmolen werden 1 uur voorverwarmd op 900°C voor decarbonisatie en vervolgens gesmolten in Pt-kroezen bij 1.550°C gedurende 1 uur.De smelt werd in koud water gegoten om een ​​glasfrit te verkrijgen, die werd gedroogd en vervolgens gemalen in een snelle agaatmolen, wat resulteerde in fijne glaspoeders met een gemiddelde deeltjesgrootte van ~10-20 m (bepaald door lichtverstrooiingstechniek, Coulter LS 230, Fraunhofer optisch model; Beckman Coulter, Brea, CA, VS).BG-kathodedoelen met een diameter van 110 mm en een dikte van 3 mm werden uit de poedervormige frit geconsolideerd door zacht persen bij kamertemperatuur in een tantaalpoortdoel.Deze procedure heeft bewezen een goede doelconsistentie te verzekeren tijdens de langdurige sputterprocessen.32,35 Hier introduceren we een eenvoudige route voor het produceren van BG-films met verschillende gehalten aan silica/polymerisatiegraden, uitgaande van hetzelfde basismateriaal.Hoogzuivere gesmolten silicaplaten (Präzisions Glas & Optik, Iserlohn, Duitsland) met een oppervlakte van 100 mm2 (dit geval) werden gefixeerd in het "racebaan" -gebied (gebied waar de meest intensieve sputterverschijnselen optreden vanwege de hoge dichtheid van magnetronplasma, wat leidt tot maximale erosie) van het BG-doel (Figuur 1).Dit maakte het mogelijk om de samenstelling en structuur van de bereide BG-coatings aan te passen, zoals hierna wordt getoond.Figuur 1 Schema's van de magnetronkathodedoelen die in het kader van deze studie worden gebruikt.Afkortingen: BG-O, films gedeponeerd vanaf het eenvoudige BG-doel;BG-3S, films afgezet van BG-target met drie silicaplaten;BG-5S, films afgezet van BG-target met vijf silicaplaten.Puur titanium (commercieel zuiver, klasse 1; Mateck GmbH, Jülich, Duitsland) platen (10 x 10 mm2) werden als substraten gebruikt.Alle substraten werden achtereenvolgens gereinigd door ultrasone trillingen in aceton, ethanol en gedestilleerd water en gedroogd door spoelen met argongas.Silicium <100> wafels waren eerder gebruikt als substraten om door optische metingen de afzettingssnelheden van de films onder de hierin beschreven sputteromstandigheden te bepalen.De BG-films werden bereid met behulp van een UVN-75R1 sputterdepositiesysteem met een vlakke magnetronkathode met een plasmaring van ~ 57 mm buitendiameter en ~ 43 mm binnendiameter, werkend op een radiofrequentie van 1,78 MHz.De vacuümkamer werd aanvankelijk geëvacueerd tot een druk van ~2x10−3 Pa. De substraten werden gedurende 10 minuten met plasma geëtst om de hechting van de film te vergroten. een werkdruk van 0,4 Pa, om eventuele resterende oppervlakkige verontreinigingen te verwijderen en de oppervlaktesamenstelling in evenwicht te brengen.Voor alle soorten doelen werd de afzetting van BG-films uitgevoerd bij dezelfde argondruk (0,4 Pa).Er werd een doel-substraatafstand van 35 mm gebruikt.Het substraat bereikte een maximale temperatuur van ~150°C (in het geval van de langste depositietijd [~3 uur]), zoals aangegeven door een ingebouwde temperatuurregelaar.De typisch lage afzettingstemperatuur in de magnetron sputterkamer maakte de conservering in de afgezette films van de amorfe toestand mogelijk.BG-coatings met verschillende silicagehaltes werden bereid met behulp van drie soorten doelen: eenvoudige (BG-O) en met drie (BG-3S) en vijf (BG-5S) silicaplaten bevestigd in het gebied van het doelcircuit (Figuur 1) .BG-coatings van gelijke dikte (~ 1 m) werden gesynthetiseerd op basis van eerder bepaalde afzettingssnelheden.De beoogde kwaliteit van het bronmateriaal voor de kathodedoelen werd voorafgaand aan de voorbereiding van de films gecontroleerd door structurele analyse.Voorafgaand aan en/of na de in vitro testen werden de samenstelling en structuur van de BG-films beoordeeld met een overvloed aan karakteriseringstechnieken, om gedetailleerde en consistente informatie te verzamelen ter ondersteuning van het vergelijkende biologische gedrag van de as-designed BG-coatings in gesimuleerde lichaamsmedia met verhoogde complexiteit en biomimetische nauwkeurigheid.De bindingsconfiguratie van het BG-doel en als gesputterde coatings, voorafgaand aan en na de in vitro testen, werd geanalyseerd met Fourier-transform infrarood (FTIR) spectroscopie (Spectrum BX II; PerkinElmer, Waltham, MA, VS).Metingen werden uitgevoerd in een verzwakte totale reflectiemodus (met behulp van een Pike Miracle-diamantkop) binnen een bereik van 570-4.000 cm−1 met een resolutie van 4 cm−1 en in totaal 128 scans per experiment.De structurele modificaties op korte afstand die naar voren kwamen in het geval van BG-coatings die in vitro in lichaamsvloeistoffen werden getest, werden lokaal verder gemeten door micro-Raman-spectroscopie met behulp van een LabRam HR 800 Evolution (Horiba, Kyoto, Japan) confocaal Raman-microscopiesysteem.De metingen werden uitgevoerd met een excitatielaser van 532 nm, met een rooster van 1800 g/mm en een objectieflens van 100×.Het invallende laservermogen op de monsters was ~ 10 mW en de spotdiameter ~ 1 m.Voor elk monster werden 128 metingen van 20 seconden integratie uitgevoerd.De oppervlaktemorfologie van de films werd onderzocht door scanning-elektronenmicroscopie (SEM) onder secundaire elektronenmodus (versnellingsspanning 15 kV) met Tescan Lyra III- en Hitachi SU-70-microscopen.Dunne geleidende koolstoffilms werden op het oppervlak van de monsters gesputterd om accumulatie van elektrische lading te voorkomen.De amorfe status van het zoals vervaardigd BG-poeder werd geverifieerd door röntgendiffractie (XRD) met een Bruker D8 Advance-diffractometer (CuKa [λ=1,5418 Å]-straling), met behulp van een zeer efficiënte LynxEye lineaire detector.De kristallografische structuur van de geweekte BG-films werd onderzocht door middel van grazing-incidence XRD (GIXRD; grazingshoek 2°) met behulp van de Bruker D8 in een parallelle bundelopstelling uitgerust met een koperanode röntgenbuis.Metingen werden uitgevoerd in het 2θ-bereik van 20° tot 60°, met een stapgrootte van 0,04° en 50 seconden acquisitie per stap.De elementaire samenstelling van de BG-films werd bepaald door middel van energie-dispersieve röntgenspectroscopie (EDS) metingen, uitgevoerd met een Bruker Quantax 400. De EDS-analyses werden uitgevoerd op vijf verschillende gebieden van 50×50 μm2 op het monsteroppervlak, de resultaten worden verder gepresenteerd als gemiddelden ± standaarddeviatie (n=5).Röntgenfoto-elektronspectroscopie (XPS) metingen werden uitgevoerd in een speciale kamer (Specs Surface Nano Analysis GmbH, Wedding, Duitsland) uitgerust met een monochromatische röntgenbron (Al Kα: hν = 1.486,7 eV).Foto-elektronen werden geregistreerd met behulp van een Phoibos 150 hemisferische analysator en een overstromingskanon dat werkte op 1 eV met een stroom van 0,1 mA, om te voorkomen dat het monster tijdens metingen wordt opgeladen.De analysator werd gebruikt in de modus met vaste transmissie met een doorlaatenergie van 20 eV, wat leidde tot een algehele resolutie van het systeem (bron + analysator) van 0,75 eV.Tijdens de metingen werd de druk onder de 3×10−9 mbar gehouden.De energieschaal werd gekalibreerd met behulp van de C-C-component van de C1s-piek bij 284,5 eV.Spectra op kernniveau werden uitgerust met Voigt-lijnen en bijbehorende integralen van het Voigt-profiel,37 elke component met zijn eigen inelastische achtergrond geassocieerd met de inelastische verstrooiing van foto-elektronen op weg naar buiten het monster.38In vitro biologisch testen van gesputterde glasfilms in fysiologische vloeistoffen met verschillende gradaties van biomimicryDe in vitro biologische activiteit van BG-monsters (dwz ~ 1 m dikke BG-coatings met een oppervlakte van 1 cm2, afgezet op 1 mm dikke Ti-coupons), weerspiegeld door hun vermogen om calciumfosfaatvorming op hun oppervlak te induceren, werd onderzocht door onderdompeling in het volgende.We voldeden aan alle indicaties in de ISO-norm: samenstelling van de oplossing (in millimol: Na+ 142, K+ 5, Mg2+ 1,5, Ca2+ 2,5, Cl− 147,8, HCO3− 4,2, HPO42− 1, SO42− 0,5), volume oplossing berekend met formule Vs=100 mm·Sa, temperatuur 36,5°C, pH 7,4, normale druk.Ook als er geen specifieke aanbeveling in de ISO-norm was, werd de SBF gefilterd door gesteriliseerde filters (cameo 25 AS-MSI, poriegrootte 0,22 m) om microbiële besmetting van het oorspronkelijke medium te voorkomen.De monsters werden bewaard in een vochtige atmosfeer om verdamping van SBF te voorkomen.Dulbecco's gemodificeerde adelaar mediumType D8437 (Sigma-Aldrich) oplossing, momenteel gebruikt als medium voor celculturen (de complexe samenstelling is te vinden op de website van de fabrikant).Alle bovengenoemde ISO 23317-standaardvereisten (opgelegd in het geval van SBF-testen) werden nageleefd (inclusief de normen voor normale atmosfeer en drukomstandigheden).Dit testmedium wordt voortaan aangeduid als "DS".DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum in normale atmosfeerAlle ISO 23317-standaardvereisten (opgelegd in het geval van SBF-testen) werden nageleefd (inclusief de normen voor normale atmosfeer en drukomstandigheden).Dit testmedium wordt verder aangeduid als "DC".DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum in homeostatische atmosfeerDit testmedium (5 kPa CO2) wordt voortaan aangeduid als “DCC”.De monsters werden 28 dagen gedrenkt in steriele polyethyleenbuizen van 15 ml met de gegeven synthetische lichaamsmedia.Alle tests werden in tweevoud uitgevoerd.Er werden voorzorgsmaatregelen genomen om de steriliteit van de monsters en flesjes te verzekeren (door droge-verhittingsprocedure bij 180°C gedurende 1 uur), evenals van de testmedia.Alle operaties werden uitgevoerd in een bioveiligheidskast met laminaire stroming die werd gebruikt voor celculturen.Elke monsterbatch werd in een bevochtigde incubator met of zonder 5% CO2 in de atmosfeer geplaatst.Na hun extractie werden de monsters voorzichtig met gedeïoniseerd water gespoeld en bij omgevingstemperatuur in een exsiccator gedroogd.Oppervlakte-verbeterde laserdesorptie/ionisatie time-of-flight massaspectroscopie-analysesDe adsorptieprofielen van eiwitten op het oppervlak van BG-films tijdens in vitro testen in complexe anorganisch-organische media werden geanalyseerd met een geavanceerde biologische analysemethode: oppervlakteversterkte laserdesorptie/ionisatie time-of-flight (SELDI -ToF) massaspectroscopie.CM10 ProteinChip® (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, VS) arrays werden geschuurd en gepolijst om het originele speciale oppervlak te verwijderen, en vervolgens voorbereid op hun coating met BG-films volgens het protocol beschreven in de sectie "Magnetron sputterdepositie".De chips werden gesteriliseerd door 1 uur droog te verwarmen op 180°C.Vervolgens werden de voorbereide monsters in de bioreactor gemonteerd, gesteriliseerd in een autoclaaf en geïncubeerd met celcultuur-DMEM met verschillende concentraties foetaal runderserum (FBS; 5%, 10% en 25%) of in zuiver FBS (100 %).Na verschillende inweektijden (6, 12, 24 en 96 uur) werden de chips gewassen met gedeïoniseerd water en werden de vlekken vervolgens geïncubeerd met 2 L energie-absorberende molecuulbuffer (5 mg sinapinezuur opgelost in 400 μL oplosmiddel bestaande uit 50% acetonitril, 0,5% trifluorazijnzuur, 49,5% H2O, hoogwaardige vloeistofchromatografiezuiverheid; Sigma Aldrich) en gedroogd in een afzuigkap met laminaire stroming.Monsters werden geanalyseerd met het ProteinChip SELDI-ToF-platform en ProteinChip Data Manager-software.Alle materialen en reagentia die in dit experiment werden gebruikt, werden gekocht bij Bio-Rad.Parameters waren: massabereik 6.000-200.000, focusmassa 25.000, matrixverzwakking 6.000, bemonsteringsfrequentie 400, kalibratiemethode PCS4000 instrumentstandaard, acquisitiemethode SELDI-kwantisatie, opwarmingsenergie 4.400 (één schot), data-energie 4.000 (tien schoten).In vitro testen in mesenchymale stamcelculturenBiocompatibiliteitstesten werden uitgevoerd in mesenchymale stamcel (MSC) kweken (Lonza, Basel, Zwitserland).De selectie van deze specifieke cellijn werd gerechtvaardigd door de hogere gevoeligheid van MSC's voor cytotoxische factoren, uit de groep cellen (bijv. fibroblasten, osteoblasten, osteoclasten, MSC's) die kunnen interageren met een bepaald implantaatoppervlak.Celproliferatie werd onderzocht met een klassieke MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium)-test (Promega Corporation, Madison, WI, VS).Nadat de MSC-culturen een voldoende mate van proliferatie en kiemvorming hadden bereikt om experimenten in drievoud uit te voeren, werden de cellen losgemaakt en gezaaid op controleoppervlakken (polycarbonaatcelcultuurcontrole) en BG-coatings met de hoogste (dwz BG-O) en laagste ( dat wil zeggen, BG-5S) concentraties van silica.Alle monsters hadden een ontworpen oppervlak van 100 mm2.MSC's werden in kweek gehouden met volledige media (DMEMα-modificatie, met 15% FBS, door GlutaMax door de producent aanbevolen verdunning en L-ascorbinezuur), en bij elke subkweekprocedure werden ze gedissocieerd tot een eencellige suspensie.Op elk type oppervlak (controles en implantaatcoatings) werden 104 cellen gezaaid in 100 L complete kweekmedia.Na 5 uur werd 1 ml compleet celkweekmedium toegevoegd.Na 24 uur kweken werd de mitochondriale activiteit bepaald met MTS.Het kweekmedium werd verwijderd en vers 400 ml celkweekmedium zonder fenolrood werd toegevoegd.Na 30 minuten werd 80 L MTS-substraat (Promega) toegevoegd en werden de platen opnieuw gedurende 1 uur in de incubator geplaatst.Volumes van 200 L van de celkweekmedia werden overgebracht naar microplaten en de absorptie werd afgelezen bij 490 nm.Celproliferatie, morfologie en mate van differentiatie werden beoordeeld door de expressie van de CD90-marker te onderzoeken door middel van indirecte immunofluorescentietest.Cellen werden 30 minuten gefixeerd met een 2% paraformaldehyde-oplossing en vervolgens gewassen en permeabel gemaakt door incubatie gedurende 30 minuten met 0,075% saponine in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; Sigma-Aldrich).Cellen werden verder driemaal gedurende 10 minuten gewassen met PBS.Het blokkeren van niet-specifieke koppelingsplaatsen werd gerealiseerd door incubatie gedurende 30 minuten met 2% runderserumalbumine (Sigma-Aldrich) in PBS.De monsters werden vervolgens geïncubeerd met een 1:50 verdunning van CD90 primair antilichaam (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, VS).Na twee wassingen met PBS van 15 minuten en één van 30 minuten werden de monsters 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met het geschikte secundaire antilichaam (antikonijn geproduceerd in geit gekoppeld aan CruzFluorTM 488; Santa Cruz Biotechnology).Na nog een set PBS-wassingen - twee van 15 minuten en één van 30 minuten - werden monsters gedurende 10 minuten geïncubeerd met 0,3 g/ml (4′,6-diamidino-2-fenylindol dihydrochloride) (DAPI) (Sigma-Aldrich).Monsters werden opnieuw drie keer gedurende 10 minuten gewassen en gemonteerd met 170 m dik dekglas en fluorescentie-montagemedium (DakoCytomation, Glostrup, Denemarken).Voor de negatieve controles van experimenten gebruikten we een incubatie van monsters met PBS met 2% runderserumalbumine, in plaats van het primaire antilichaam.Analyse van statistische significantie werd uitgevoerd met behulp van de ongepaarde Student's t-test.Verschillen werden als significant beschouwd wanneer P<0,05.Karakterisering van startend BG-poeder en als gesputterde BG-coatingsXRD-analyses uitgevoerd in symmetrische (θ-θ) geometrie bevestigden de amorfe status (binnen de experimentele gevoeligheidslimiet) van het BG-O-doelmateriaal (Figuur 2).Het patroon werd gedomineerd door een uitgesproken halo gecentreerd op 2θ≈29°–30°, kenmerkend voor een op glasachtige silica gebaseerde verbinding.39Figuur 2 XRD-patroon van het BG-O-doelpoeder vastgelegd in symmetrische (θ-θ) geometrie.Afkortingen: XRD, röntgendiffractie;BG-O, eenvoudig BG-doel.Micro-Raman-analyse ondersteunde de XRD-bevindingen, wat verder de sterk gedepolymeriseerde structuur van het BG-O-poeder aantoont (Figuur 3), gedomineerd door de tetraëdrische structurele eenheden (QSi) met twee niet-overbruggende zuurstofatomen. De prominente brede Raman-band van het spectrum, gepositioneerd in het golfgetalgebied van 900-1.100 cm-1, had het maximum gecentreerd op 956 cm-1, met betrekking tot de ringen en kettingen en twee zwakkere schouders, met een piek van ~869 cm-1 en ~1040 cm-1 (toegeschreven aan de bijdrage van respectievelijk monomeren en aan de tweedimensionale eenheden).40–43 Typische banden van schommelende (ρ) beweging van overbruggende zuurstof in structurele eenheden die niet-overbruggende zuurstof bevatten (~623 cm−1) en symmetrische zuurstofuitrekking van Si–O– Si en symmetrische O-Si-O hoekvervorming van de gekoppelde silicaatgroepen (470-420 cm-1 gebied) zijn ook aangetoond.40,43Figuur 3 Raman-spectra van BG-O-doelmateriaal en zuivere poeders van calciet, β-tricalciumfosfaat (βTCP) en hydroxyapatiet (HA).Opmerkingen: Spectra in twee ingezoomde relevante golfgetalgebieden: 350-750 cm-1 (A) en 820-1.120 cm-1 (B).Voor een betere visuele vergelijking werden de spectra genormaliseerd naar de intensiteit van de meest prominente band, gecentreerd op ~ 950-1.000 cm−1.Afkorting: BG, bioactief glas.Tabel 2 presenteert de vergelijkende oxidesamenstellingen van het BG-poeder en BG-O, BG-3S en BG-5S gesputterde films, samen met de overeenkomstige NC-waarden berekend met de formule voorgesteld in Kapoor et al.44 Progressieve silicaverrijking van de BG films werden waargenomen: BG-O < BG-3S < BG-5S.Een antagonistische relatie tussen SiO2 en CaO werd weergegeven door de EDS-resultaten.Toen de SiO2:BG-verhouding in het doelgebied van de racebaan werd verhoogd, werd het SiO2-gehalte geleidelijk verhoogd, waarbij de CaO-concentratie evenredig afnam.Er werden geen substantiële P2O5-, MgO- of ZnO-concentratiemodificaties opgemerkt onder BG-films.De P2O5- en ZnO-gehalten bleken echter lager te zijn in het geval van alle as-sputtered BG-films in vergelijking met de ouder-doelsamenstelling.Dit wordt bepaald door de hoge vluchtigheid van deze soorten.45,46Tabel 2 Oxideconcentratie (mol%) en NC van eenvoudige kathodetargets en BG-coatings Opmerking: Vanwege de verminderde concentratie en lage nauwkeurigheid van EDS-analyse voor lichte elementen, kon het fluorgehalte niet worden gekwantificeerd.Afkortingen: BG, bioactief glas;EDS, energie-dispersieve röntgenspectroscopie;NC, netwerkconnectiviteit;BG-O, films die zijn afgezet vanaf het eenvoudige BG-doel;BG-3S, films afgezet van BG-doelwit met drie silicaplaten;BG-5S, films afgezet van BG-target met vijf silicaplaten.Het BG-O-doel en de films presenteerden analoge infraroodomhullingen die hun nauwe structurele gelijkenis aangeven, met een sterk gedepolymeriseerde glasstructuur die wordt gedomineerd door de silicaattetraëdrische eenheden met verschillende aantallen niet-overbruggende zuurstofatomen.Overlappende IR-trillingsbanden van de , , en eenheden, die opduiken in het golfgetalgebied van 850-1,010 cm-1, 40,47-49, vormden een solide getuigenis van de lage NC van deze BG-structuren.De bijdrage van P-O-bindingstrillingen (opgewekt door de orthofosfaat-functionele groepen, die typisch de dominante fosfaatomgeving zijn in dergelijke glassamenstellingen),50 is moeilijk af te leiden, vanwege het lage P-gehalte van de films en de superpositie van de IR-banden met de hoogste intensiteit van fosfaat met die van silicaat.40Zoals verwacht werd de geleidelijke toename van het silicagehalte van de BG-3S- en BG-5S-films weerspiegeld in een verhoging van de polymerisatiegraad van het glasnetwerk van de films.FTIR-spectra (Figuur 4) gaven een intensiteitsverbetering aan van de band gepositioneerd op ~ 1.030 - 1.050 cm-1, geassocieerd met de strekkende trillingen van overbruggende zuurstofatomen (Si-O-Si) in alle silicaatsoorten.Biochim Biophys Acta.Alle rechten voorbehouden.Geregistreerd in Engeland en Wales.